English
Alternativou ke krmení klíšťat na laboratorních zvířatech je jejich membránové sání. Umělé (membránové) sání má již poměrně dlouhou historii ve výzkumu biologie krev sajících členovců a zahrnuje škálu více či méně úspěšných experimentálních matric: od zvířecích vypraných střívek, přes umělá střívka až po Parafilm® nebo speciální edice nelubrikovaných prezervativů. Umělé sání je poměrně snadno proveditelné u krev sajícího hmyzu, protože doba potřebná pro plné dosátí je relativně krátká, trvá v řádu několika minut. Naopak u klíšťat, která sají na svém hostiteli i několik dní (v závislosti na životním stadiu klíštěte), představuje doba potřebná pro plné dosátí výraznou metodickou komplikaci.
Foto: Jan Erhart, Archiv BC AV ČR
Obr. 1 – Membránové sání nymf a dospělých samic klíštěte Ixodes ricinus
Úspěšné zavedení experimentálního krmení evropského klíštěte Ixodes ricinus na umělých membránách se podařilo před zhruba 10 lety vyvinout na univerzitě ve švýcarském Neuchâtelu v laboratoři dr. Patricka Guerina. V současnosti se metoda membránového sání klíšťat s úspěchem používá i v Parazitologickém ústavu BC AV ČR v Českých Budějovicích a využívá se jak pro studium fyziologie klíšťat, tak i při experimentálních modelech přenosu patogenů.
Membránové sání není primárně určeno k udržování chovu klíšťat. Spíše nabízí rozmanité spektrum experimentálních nastavení, která nelze provést na živých hostitelích. V Laboratoři imunologie vektorů PaÚ BC AV ČR je rutinně zaveden membránový systém pro sání dospělých samic klíštěte I. ricinus. Krmící systém se skládá ze speciální tenké silikonové membrány, která umožňuje proniknutí hypostomů (adaptovaného ústního ústrojí klíšťat) k defibrinované krvi. Klíšťata se lákají k přisátí na membráně pomocí zvláštních „parfémů“ extrahovaných ze srsti zvířat. V současnosti se systém optimalizuje i pro nymfální stadia (obr. 1), jež hrají nejvýznamnější roli při infekci klíšťaty přenášených patogenů (Borrelia spp., Babesia spp., Anaplasma spp. aj.).
Další výzvou je vývoj definovaného média pro klíštěcí sání. Aktuálně se většinou používá defibrinovaná hovězí krev dodávaná z jatek, u které lze jen stěží zajistit sterilitu a konstantní složení. Určení definovaného média by umožnilo snáze porovnávat výsledky jednotlivých studií mezi laboratořemi a zároveň delší skladování a okamžitou přípravu.
Základní výzkum orientujeme na dvě témata. První z nich se nazývá Co dělá klíště parazitem? – jinými slovy, co si musí klíště brát z hostitelské krve, aby mohlo přežít a rozmnožovat se. Jelikož si lze jen těžko představit, že by se odebíraly či přidávaly jednotlivé složky krve v živém hostiteli, membránové sání nabízí dosud nepří-stupnou sérii pokusů určujících závislost klíšťat na jednotlivých složkách krve. Definování složek kultivačních médií umožnilo i velký průlom ve studiu jednobuněčných parazitů. Tito parazité mají oproti svým volně žijícím protějškům často zredukované některé metabolické dráhy a spíše spoléhají na získávání potřebných meziproduktů ze svého hostitele. Zdá se, že i klíště ztratilo jednu důležitou anabolickou dráhu oproti neparazitickým příbuzným z řad roztočů. Klíšťata si neumí vytvářet molekulu hemu a tento životně důležitý kofaktor mnoha enzymů si berou výhradně z hostitelské krve (hemoglobinu) a transportují ho do ostatních tkání. Výsledky studie založené na membránovém sání klíšťat na plné krvi nebo séru (obr. 2) shrnuje publikace, která je právě v recenzním řízení.
Obr. 2 – Dospělé samice I. ricinus nasáté na plné krvi (nalevo) nebo na séru (napravo)
Ovlivňování aktivity některých imunitních složek v potravě umožňuje řešit i další problematiku: Jak se klíště brání imunitní a zánětlivé odpovědi hostitele? Je pozoruhodné, že klíšťata rodu Ixodes mohou sát na hostiteli až deset dní, a přesto je hostitel poměrně bezbranný při snaze klíště vypudit. Existuje mnoho studií popisujících jednotlivé pochody imunitní obrany, které jsou indukovány klíštěcím sáním. Klíště si ale zřejmě vyvinulo účinné mechanismy, jak dané imunitní a zánětlivé rekce potlačovat. Právě realizovaná studie (ve spolupráci s prof. José Ribeirem z Národního ústavu zdraví v USA – NIH/NIAID) postupně rozkrývá, do jaké míry modeluje hostitelská imunita expresy proteinů ve slinných žlázách klíštěte, které jsou následně „plivány“ do místa sání. Časté obměňování repertoáru sekretovaných slinných proteinů zřejmě umožnuje klíštěti tak dlouhé setrvání na hostiteli. Další experimentální možnosti se nabízejí i pro studium klíšťaty přenášených patogenů a dynamiky přenosu.
Systém membránového sání dovoluje nejen realizovat dosud experimentálně nepřístupné pokusy základního výzkumu, ale má také značný potenciál v aplikované sféře.
V kontextu aplikované sféry bychom rádi uplatnili membránový systém k testování protiklíštěcích farmak. Testovací schémata umožnují ověřování protiklíštěcích repelentů, léčiv a vakcín, popřípadě látek bránících přenosu klíštaty přenášených patogenů. Testování se uskutečňuje na membránovém sání, a tak testovaný produkt může při splnění podmínek získat certifikát NEtestováno na zvířatech vyhovující standardům například Humane Cosmetics Standard (HCS).
JAN PERNER, MATĚJ KUČERA, PETR KOPÁČEK,
Parazitologický ústav BC AV ČR, v. v. i.