English
Jedině drzá troufalost podporovaná naivní neznalostí mohla způsobit, že můj první standardní projekt sdružoval pět institucí a 20 vědců. Jinak bych se neupsala úkolu, že povedu tým, v němž spoluřešiteli budou docenti a profesoři s alespoň deseti lety zkušeností navíc. V panice jsem se čtyři roky snažila stíhat úkoly týkající se zkoumání adaptací netopýrů na plísňové onemocnění, syndrom bílého nosu. Nakonec to dopadlo víc než dobře.
Foto: Ondřej Šebesta
Léze syndromu bílého nosu, kde plíseň Pseudogymnoascus destructans pronikla do vlasového folikulu zimujícího netopýra.
Syndrom bílého nosu (white-nose syndrome, WNS) má značný ekonomický dopad, i když přímo neohrožuje ani člověka ani námi využívaná zvířata nebo rostliny. Jeho původce, plíseň Pseudogymnoascus destructans, napadá netopýry během zimování. V Severní Americe se od objevení WNS v roce 2006 nemoc rychle šíří a za invazní vlnou zůstávají zdecimované populace. Ekosystémovou roli hmyzožravých netopýrů přebírají lidé, kteří zintenzivňují, a tedy předražují opatření proti škůdcům. Měli jsme tehdy obavy, že se podobný scénář objeví i u nás. Při první návštěvě jeskyně s výskytem jedinců postižených WNS jsme pár metrů od vchodu našli mrtvého netopýra s bílým nosem. Uhynul sice na WNS, ale další roky přinesly stabilitu ve velikostech populací i v dlouhodobé aktivitě během zimy. Mohli jsme se pustit do zkoumání důvodů, proč naše zvířata na WNS neumírají v tak vysokém počtu jako za Atlantikem.
Foto: Jiří Pikula
Letní kolonie netopýra velkého a létavce stěhovavého (uprostřed). Oba druhy postihuje syndrom bílého nosu, i když létavec stěhovavý je subtropický druh, který zimuje jenom v nejsevernějších oblastech svého rozšíření.
Křižovatka přežití
Logicky, evropské populace přežívají lépe proto, že některá složka epidemiologického trojúhelníku zamezuje rozvoji nemoci. Pokusili jsme se všechny prozkoumat. Podmínky v našich zimovištích se můžou odlišovat tím, že nejsou natolik vhodné pro růst plísně jako zimoviště v silně postižených oblastech Severní Ameriky. Patogenní plíseň z Evropy by se mohla lišit od severoamerického kmene jak fyziologicky, tak i geneticky. Hostitelské druhy nearktických netopýrů nejsou příbuzné palearktickým; jinak se chovají, anebo se u nich vyvinula adaptace vůči selekčnímu tlaku podmíněnému infekcí.
Jenomže úskalí naprosto nového modelového systému je akutní, a navíc – v celosvětovém měřítku – máme všeho nedostatek. Vzorků, poznatků, zkušeností, nástrojů. V týmu, který pracoval v terénu na získávání materiálu, se sešli dva lidé s klaustrofobií. Takový člověk nemá strach, že by se na něj mohl svalit strop jeskyně nebo štoly. On přímo bytostně cítí, že na něm leží desítky metrů skály a bahna hned u vstupu do jeskyně, a celodenní práce pro něj představuje obrovskou psychickou zátěž – mnohem větší než noční odchyty při výletech ze zimovišť. Výzkum o nervy a nejen kvůli klaustrofobii. Obzvláště na Sibiři, na konci série čtyř expedic, během nichž jsme zmapovali Eurasii od Česka přes Slovinsko, Lotyšsko až po ruské oblasti na Urale, okolí jezera Bajkal a zimoviště v Primorském kraji. V horách, dvě hodiny cesty autem od nejbližší vesnice a pět od Vladivostoku, nemohl náš průvodce dva a půl dne ze čtyř na akci vyčleněných nalézt jeskyni. Při pobíhání po kopcích a brodění se ledovými řekami jsem přemýšlela, jak do zdůvodnění zahraniční cesty napíši, že výsledky nemáme, protože jsme poslouchali samé „maybe here.“ Naštěstí údolí našel a odběr vzácných vzorků ze severovýchodní Asie jsme dnem i nocí dotáhli k úspěchu.
Foto: Jan Zukal
Natália Martínková a Jiří Pikula vyšetřují pomocí prosvícení ultrafialovým světlem netopýra na syndrom bílého nosu. Zvýšená ochranná opatření jsou na místě při výzkumu na nových lokalitách.
Vyvinuli jsme čtyři metodiky, které se ukázaly pro výzkum WNS jako klíčové. Bioinformatickou metodu SigHunt jsme potřebovali k rozlišování horizontálně přenesené genetické informace v eukaryotických genomech. Mikroorganismy mohou získat funkční sadu genů kódujících metabolické procesy k využívání nových ekologických prostor. Například bakterie si mezidruhově vyměňují geny pro rezistenci k léčivům, takže přežívají i ve tkáních prosycených antibiotiky. Novou metodu pro eukaryotické organismy SigHunt jsme použili k hledání vlastností, které P. destructans umožňují parazitický způsob života, i když patří do skupiny saprofytů. Druhá metodika ke zkoumání WNS umožnila průlom v diagnostice onemocnění bez nutnosti obětovat zvíře. Neletální odběr biopsií z křídel navádíme fluorescencí WNS lézí v ultrafialovém světle. Snižujeme tak dopad výzkumu na netopýry a zároveň jsme schopni získat dostatečný počet vzorků pro statistické hodnocení. Od UV diagnostiky se rozvinula metodika skórování patologického nálezu z bioptátu. Umožňuje přímé porovnání závažnosti onemocnění mezi druhy na globální úrovni a případně i pozorování rozvoje nemoci během zimování. Čtvrtý nástroj, izolace buněčných kultur z netopýrů, revolucionizoval naše možnosti experimentování při hledání molekulárních mechanismů interakcí mezi patogenem a hostitelem.
Tanec za studena
Plíseň P. destructans roste jenom v chladu, a tak je její patogenicita omezena podmínkami v podzemí. Jelikož přestává růst při asi 20 stupních Celsia, není nebezpečná pro člověka a netopýry ohrožuje výlučně v zimním období, kdy upadají do zimního spánku. Tehdy se u nich přirozeně střídají asi dvoutýdenní období tuhosti s teplotou těla blízkou teplotě prostředí a krátká probuzení se zahřátím. Zvířata během probuzení změní stanoviště, pijí, vyprazdňují se, páří nebo spí. Nearktický netopýr s WNS se ale s postupujícím rozvojem nemoci budí častěji. Ke každému zahřátí spotřebuje část energie uložené v tuku, kterou v zimě není schopen nahradit. Tragédie nastává, pokud mu dojdou tukové zásoby dřív, než nastane jaro a venku znovu začne létat hmyz.
Foto: Jiří Pikula
Měření povrchové teploty netopýra velkého s viditelným bílošedým porostem plísní Pseudogymnoascus destructans.
Předpokládali jsme, že vzbuzený netopýr zvýšenou teplotou a pohybem vyruší ostatní ve skupině. Skupinové zimování je totiž energeticky výhodné a dotýkající se zvířata efektivněji využívají vzájemné termoregulace ke snížení výdeje energie pro jednotlivce. Skupiny netopýrů jsou v Evropě obecně menší než v Severní Americe, což vede k paradoxu, jako by se palearktičtí netopýři vzdávali energetických výhod davu. Byli jsme připraveni obvinit WNS a tvrdit, že menší skupiny nebo zimování jednotlivě jsou behaviorální adaptací na WNS. Zamezí vyrušování skupiny a časté buzení neovlivní okolní zvířata. Ve skutečnosti se WNS jako důvod pro tvorbu malých skupin jeví velice nadějně. V rozsáhlé mezinárodní spolupráci jsme pozorovali, že počty netopýrů v zimovištích Severní Ameriky se po invazní vlně WNS snížily na hodnoty běžné v zimovištích Evropy. Jenomže nás to neuspokojilo a šli jsme ve výzkumu dál. Po WNS zbývá v Americe celkově málo zvířat, tak jak by z mála mohly vzniknout velké skupiny? Do dvou zimovišť s prevalencí WNS blížící se stu procentům jsme nainstalovali termokamery. Chtěli jsme zjistit, jak často se netopýři budí a jak intenzivně se tím vzájemně ruší. Přidali jsme infračervené kamery pro ověření, zda termokamera zaznamenává všechno dění na zimovišti. Nezaznamenává. Z paralelních záběrů termo- a infračervené kamery na jednu skupinu jsme zjistili, že netopýři se občas pohybují po stěně zimoviště, i když teplota jejich těla nepřesáhne pět stupňů. Je to těžko představitelné, jelikož pohyb za nízkých teplot musí zvířata bolet a výzkumy na jiných modelech dokonce ukazují patologické změny ve svalech už při tří- až čtyřnásobně vyšších teplotách těla. Pohyb za studena ale s WNS zřejmě nesouvisí. Předběžně se navíc zdá, že netopýři se vzájemně ve skupině nebudí a zahřátí jednoho jedince málokdy vede ke kaskádě, kdy se vzbudí skupina.
Foto: Luboš Minařík
Natália Martínková v jeskyni Kanibalka v Moravském krasu.
Rozsáhlý průšvih
WNS výrazně poškozuje kůži, ale na rozdíl od jiných plísňových infekcí se nešíří do vnitřních orgánů. Navzdory tomu bývá onemocnění fatální. Plíseň pomalu vrůstá do vlasových kořínků, mazových žláz a do pokožky, kde tvoří shluky hyf a spor ve tvaru mističek nebo pohárků. Léze se prohlubuje, proniká přes bazální membránu do hlubších vrstev tkání, až může prorůst celou šíři křídla skrz svalová vlákna, cévy a další tkáně. Pseudogymnoascus destructans ale roste velice pomalu a plocha jedné WNS léze hustě vyplněné plísní je na konci zimy menší než tečka za větou. Palearktičtí netopýři jich mívají kolem třinácti, ale někteří silně postižení chudáci i stovky až tisíce. Vícenásobné léze sice na povrchu kůže splývají, ale v hloubce si zachovávají pohárkový tvar. Na histologickém preparátu má těžce postižené zvíře kůži ozdobenou krajkovou vlnkou nárůstu plísně nabarvené sytě fialově. Pod mikroskopem krásný pohled ve skutečnosti dokládá značné utrpení. Netopýr během zimování snižuje svůj metabolismus včetně imunitního systému a okolí léze je proto příliš často klidné, bez viditelné reakce na přítomnost patogenu. Ještě překvapivější je situace, kdy WNS lézi obklopuje rozsáhlá nekróza, ale imunitní systém se s nákazou nevypořádává. Invazi neutrofilů v zánětu člověk z „WNS komunity“ pak vítá se spokojeným výdechem a nervozitou jiného typu. Netopýr se probudil, a pokud ho agresivní imunitní reakce nezabije, léze se odhojí a opadají ve stroupcích. Celý průběh WNS se jeví natolik jasný a přehledný, až je frustrující, že náš tým zůstává dodnes jediný, který umí WNS v Evropě diagnostikovat. Loni však Američani nalezli jedno zvíře pozitivní na WNS v severní Číně, a tak se snad konečně recenze našich prací přestanou vracet s výtkou, že WNS mimo Severní Ameriku neexistuje. Abychom se ujistili, že diagnostikovat WNS je opravdu snadné, děláme pokusy se studenty Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně. Při cvičení využíváme crowd-sourcing ke zjištění, jaké míry shody se zkušeným patologem dosáhnou začátečníci. Se škodolibostí namířenou vůči recenzentům se těším, že by mohla být značná.
Foto: Jiří Pikula
Netopýr velký s rozsáhlým porostem plísně Pseudogymnoascus destructans
Infekce plísní P. destructans se přenáší několika způsoby. Netopýři se infikují přímým kontaktem s jinými jedinci, nebo kontaktem se stěnou zimoviště v místě, kde se plíseň vyskytuje. Možným způsobem nákazy může být i pasivní přenos plísně na ektoparazitech. Ochranou před nákazou je izolace – nedotýkat se nemocných zvířat ani míst, kde se zdržovala. Zimovat samostatně, mimo podzemí nebo v mimořádně studených místech, kde se růst plísně ještě víc zpomaluje. Palearktičtí netopýři skutečně zimují v menších skupinách než jejich nearktičtí příbuzní, ale víme, že tomu tak není proto, že by se vzájemně budili. Mohli by zimováním osamoceně omezovat právě přenos infekce. Bohužel takhle logicky WNS nefunguje. Následovalo další překvapivé zjištění. Na WNS onemocní zvířata se všemi strategiemi hibernace a bez ohledu na příbuznost. Pseudogymnoascus destructans napadá všechny jedince, k nimž se dostane. Dodnes jsme nenašli rezistentní druh, i když druhy zimujících netopýrů dělí desítky milionů let evoluce. Různý původ hostitele nehraje pro plíseň roli. Dokonce jsme předpověděli infekci i u těch druhů, které zimují ve stromech, a její rozšíření u subtropických netopýrů v severních částech jejich areálů. Náš model je správný; do roka američtí kolegové nalezli infikované stromové druhy a my zástupce severoafrického druhu nemocné na WNS.
Foto: Jiří Pikula
WNS léze září pod ultrafialovým světlem žlutooranžovou barvou kvůli nahromaděnému riboflavinu. Nekróza v okolí léze se jeví jako tmavá skvrna.
Když jsme zjistili, že naše modely předpovídají WNS prakticky u všech našich zimujících netopýrů, první reakce se nesla v duchu: „Pojďme studovat medvědy!“ Nápad byl přijatý s větším nadšením, než by si zasloužil. Domluvili jsme se, že pokud nám někdo schválí projekt pokusu s alespoň desetiprocentní předpokládanou úmrtností jak na straně chráněných, zkoumaných subjektů, tak i u členů výzkumného týmu, půjdeme s uspávací puškou k brlohům zjistit, zda povrchová teplota medvěda klesne dostatečně, aby na něm rostla netopýří plíseň. WNS výzkum je pro černý humor skvělou živnou půdou.
I když mohou být infikovány všechny druhy, na netopýrech nalézáme řádové rozdíly v množství plísně na povrchu křídla. V detailech se projevuje i efekt podobnosti a příbuzné druhy jsou si v množství plísně podobnější. Pro globální hodnocení a perspektivu je důležité, že rozsah množství plísně známé z palearktických zvířat zahrnuje rozsah množství plísně z nearktických netopýrů. Palearktičtí netopýři mají tedy podobné množství plísně na povrchu křídla a stejný patologický nález jako nearktické druhy. Navíc, prevalence onemocnění je u nás vysoká, u některých druhů jsou infikováni všichni jedinci, a meziročně se údaje nemění. Situace, kdy se infekční onemocnění v populaci vyskytuje dlouhodobě ve vysoké prevalenci, naznačuje, že mezi hostitelem a patogenem došlo k nastolení evoluční rovnováhy. Vzhledem ke stabilní velikosti populací palearktických netopýrů má tato rovnováha podobu tolerance WNS.
Foto: Jiří Pikula
Solitérní zimování by mohlo chránit před přenosem infekční plísně mezi jedinci, ale i vrápenec malý bývá postižený.
Foto: Jiří Pikula
Vstup do jeskyně během pozdního zimování
Vražedný vitamin
Nahrazení tkání živočicha vlákny plísně, léze, infarkty, nekrózy. Pseudogymnoascus destructans likviduje kůži ve velkém. Hypotézy, které vysvětlují umírání postižených zvířat, využívají tři hlavní komponenty provázející kožní infekci – svědění, ztrátu ochranné funkce pokožky a následné hojení. Nalezení mrtví netopýři s WNS mívají vyčerpané zásoby tuku a tedy i energie. Jedna z hypotéz proto předpokládá, že léze netopýry budí; ti při zahřátí těla o téměř 30 stupňů spotřebují tukové zásoby a hynou na celkové vyčerpání organismu. Jelikož léze narušují povrch pokožky na rozsáhlé ploše těla, ranami se intenzivněji vypařuje voda. Tělní tekutiny se tak zahušťují a netopýři umírají na narušení rovnováhy solí v organismu. Pokud přece jenom přežijí zimu, po probuzení se jim opětovně zvýší metabolismus na úroveň v aktivním a reprodukčním období. S těmito změnami souvisí i zvýšení obranyschopnosti imunitního systému – imunitní buňky vyhledají patogen, zneškodní ho a hojí rány. Při výskytu rozsáhlých lézí však může být imunitní reakce nezvladatelně silná a netopýr umírá.
Foto: Jiří Pikula
Netopýr pobřežní a netopýr Brandtův zimují se společné skupině. Jedinec v popředí má na křídlech a u nosu nárůst plísně Pseudogymnoascus destructans.
V současnosti dovedeme všechny alternativní hypotézy sjednotit do hutné WNS teorie všeho. Víme, proč v okolí WNS lézí odumírá i nenapadená tkáň a jak se stupňuje imunitní odpověď. Plíseň do svého prostředí v kožních lézích totiž vylučuje riboflavin, vitamin B2. Ve specifických podmínkách hibernace netopýr riboflavin neabsorbuje, nezpracovává a nevylučuje, a ten se postupně hromadí. Za měsíce růstu plísně a sekrece riboflavinu se jeho koncentrace v lézích zvyšuje a vznikají depozity. Právě fotofluorescenční vlastnosti riboflavinu umožňují nalézt při prosvícení křídla UV světlem i malou WNS lézi, která jasně září a i v terénních podmínkách je viditelná prostým okem. Jenomže velké množství riboflavinu je škodlivé a při styku s kyslíkem a světlem produkuje volné radikály, což vede k oxidačnímu poškození buněk. Zjistili jsme, že u zimujících netopýrů se v lézích vyskytuje takové množství riboflavinu, které je cytotoxické pro fibroblasty netopýrů kultivované v podobných podmínkách, v jakých zvířata zimují. Cytotoxicita se u nemocného netopýra projeví jako nekróza v okolí WNS léze, kterou skutečně u značného počtu jedinců nalézáme. Netopýři na jaře vylétávají ze zimovišť za šera a světlo tak může dále ovlivnit chemické procesy v okolí depozitů riboflavinu. I krátké osvícení nízkou intenzitou světla způsobuje buňkám ošetřeným riboflavinem oxidační stres. Navíc, specifické buňky imunitního systému ze skupiny T lymfocytů využívají riboflavin a jeho metabolity k vyhledávání mikrobiální infekce. Do míst, kde P. destructans ukládá velké množství riboflavinu, vylučují prozánětlivé cytokininy a zhoršují tak patologický nález netopýrů brzy po probuzení.
Foto: Jiří Pikula
Ektoparazité netopýrů, zde roztoč rodu Spinturnix, mohou na těle přenášet spóry a hyfy patogenní plísně Pseudogymnoascus destructans.
Foto: Alena Kubátová
Spóry patogenní plísně Pseudogymnoascus destructans
Jedna malá molekula tak propojuje existující hypotézy o patogenezi WNS. Přispívá jak k rozšíření poškození křídel netopýrů, tak i k drtivé imunitní reakci po probuzení. Ani vysoké koncentrace riboflavinu ale nejsou pro plíseň škodlivé. Obzvláště z tohoto aspektu její patogenicity je proto zajímavé, že genom P. destructans obsahuje horizontálně přenesené geny s doménami, které vážou a využívají metabolické produkty riboflavinu.
V období psaní průběžných zpráv, pro řešitele periodicky nejtěžších časech, mi kolegyně jednou empaticky řekla, že mám pořádný Dream Team. Jakkoli to bylo myšleno sarkasticky, pokrok jí dal za pravdu. Doslova. Podle výsledků jsem skutečně měla tým snů, který změnil pohled na WNS. Z našeho výzkumu vyplývá, že proti drastické kožní infekci se může vyvinout tolerance. V současnosti se v humánní medicíně začíná skloňovat slovo tolerance infekčních onemocnění jako alternativa k selhávajícím antimikrobiálním léčivům. Způsob, jakým se u netopýrů vyvinula tolerance vůči WNS, může v tomto kontextu představovat pozoruhodný model. Česká „WNS skupina“ otevřela mimořádně perspektivní možnosti.
NATÁLIA MARTÍNKOVÁ,
Ústav biologie obratlovců AV ČR, v. v. i.