English
Nestává se často, aby jeden z nejprestižnějších vědeckých časopisů, americký Science, otiskl na obálce obrázek zemědělské plodiny, uvnitř čtyři články o ní a navíc ještě doprovodný komentář. Dne 18. července 2014 to tak bylo a onou plodinou byla pšenice, přesněji pšenice setá (Triticum aestivum L.). Zájem o téma červencovým číslem neskončil a v listopadu redaktoři časopisu nominovali publikované výsledky na „Breakthrough of the Year 2014“. Příčinou mimořádné pozornosti je průlom ve čtení dědičné informace této plodiny a nové poznatky, které se jeho prostřednictvím podařilo získat. Co konkrétního vyvolalo takovou pozornost vědecké obce?
Foto: Archiv ÚEB AV ČR
Pšenice patří s rýží a kukuřicí k nejdůležitějším plodinám a je základním zdrojem obživy pro třetinu lidstva, kterému poskytuje asi 20 % kalorií a (což se běžně neví) také asi 20 % bílkovin. Každoročně se jí sklidí asi 700 milionů tun; více, přibližně jedna miliarda tun, se sklidí pouze kukuřice, která se však používá především jako krmivo, v potravinářském průmyslu a na výrobu etanolu. Předností pšenice oproti rýži a kukuřici je její plasticita; proto ji lze pěstovat v rozmanitějších klimatických podmínkách. I přesto začíná být s její produkcí problém. V posledních desetiletích se jí sklidilo méně, než lidstvo spotřebovalo, a logickým důsledkem je pokles světových zásob. Zatímco v 80. letech by zásoba pšenice lidstvu vydržela asi čtyři měsíce, v současnosti jen něco přes dva měsíce. Pokud by měl tento trend pokračovat, mohla by větší neúroda způsobit nedostatek a ohrozit výživu světové populace. Aby toho nebylo málo, zatím vše nasvědčuje tomu, že v roce 2050 bude na Zemi žít devět miliard lidí, kteří spotřebují o 50–70 % více potravin, než lidstvo spotřebovalo v roce 2000; ty přitom bude muset vyprodukovat na stejné ploše zemědělské půdy. Navíc se začínají projevovat dopady změny klimatu, které zemědělskou produkci ohrožují extrémními výkyvy počasí a suchem.
Hrozí tedy rozsáhlým oblastem světa hladomor? V moderní historii již lidstvo takové nebezpečí zažilo, a to v šedesátých letech minulého století. Nárůst populace vyvolal nedostatek potravin především v Indii a dalších zemích Asie, Afriky a Latinské Ameriky. Situaci tehdy zachránily nově vyšlechtěné odrůdy obilnin a zavedení moderních pěstebních technik včetně lepšího využívání hnojiv. Světová produkce obilnin se v důsledku toho téměř ztrojnásobila a nebezpečí hladomoru bylo zažehnáno. Jedním z hlavních strůjců tzv. Zelené revoluce byl americký šlechtitel Norman Borlaug, který působil v Mezinárodním centru pro šlechtění kukuřice a pšenice (Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo – CIMMYT) v Mexiku a za své zásluhy obdržel v roce 1970 Nobelovu cenu míru. Lidstvo mu vděčí za mnohé, avšak nedá se říci, že by se jeho radami řídilo. Již v roce 1969 N. Borlaug varoval, že Zelená revoluce poskytla lidstvu jen několik desítek let, aby se mohlo systematicky zabývat šlechtěním a zvyšováním zemědělské produkce, a tak odvrátilo riziko návratu potravinové krize. Nic takového se však nestalo a investice do zemědělského výzkumu a obecně do výzkumu v oblasti rostlinných věd od té doby klesaly. V současnosti si však nebezpečí uvědomuje stále více lidí a začíná se mluvit o potřebě druhé Zelené revoluce.
Herakleitovské „nevstoupíš dvakrát do téže řeky“ však platí i v tomto případě a metody použité N. Borlaugem a dalšími v první Zelené revoluci nebudou stačit, respektive jejich možnosti se již do značné míry vyčerpaly. Zajistit požadovanou produkci pšenice v roce 2050 bude možné jen tehdy, pokud budou výnosy nových odrůd stoupat o 2 % ročně. Takového růstu lze však dosáhnout jen intenzivním šlechtěním, které využívá metody molekulární biologie a genomiky a také biotechnologické metody, včetně genetické transformace a editace dědičné informace. Zatímco genetická transformace (tj. vložení malé části dědičné informace z jiného organismu) a editace dědičné informace (tj. změna části dědičné informace) se u pšenice zatím používají jen ve výzkumných laboratořích, využití molekulárních technik ve šlechtění již bylo ověřeno a zejména větší šlechtitelské firmy je začínají využívat. V tomto případě jde zejména o výběr vhodných rodičů pro křížení a výběr potomstev s požadovanými vlastnostmi ještě před vysetím na pole. K tomu slouží tzv. molekulární markery – malé úseky dědičné informace, které se přenášejí na potomstvo společně s geny pro požadované vlastnosti. Rozsáhlejší zapojení těchto metod do šlechtitelských programů a plné využití jejich potenciálu však nebude uskutečnitelné bez podrobné znalosti dědičné informace (genomu) pšenice.
Obr. 1 – Fylogeneze pšenice seté. Na vzniku tohoto důležitého druhu se podílely tři druhy trav, které se spolu postupně křížily.
Pokrok ve vývoji metod čtení dědičné informace (sekvenování) a vývoji přístrojů pro sekvenování (sekvenátorů) dosáhl značné úrovně: existují pří-stroje schopné přečíst stovky miliard bází DNA (písmen dědičného kódu) během několika dnů. Proč tedy ještě neznáme úplnou dědičnou informaci tak důležité plodiny? Je to legitimní otázka, zejména vzhledem k tomu, že dědičná informace dalších dvou z trojice nejdůležitějších plodin – rýže i kukuřice – již přečtena byla. Proč tedy ne dědičná informace pšenice? Důvodem je její struktura, která odráží vznik druhu. Podílely se na něm postupně tři různé druhy planých trav (obr. 1). Nejprve se asi před půl milionem roků náhodně zkřížily dva z nich – Triticum urartu Tum. ex. Gandil. a dosud neznámý druh, který se podobá současné plané trávě Aegilops speltoides Tausch. Svému potomku daly do vínku obě sady svých chromozómů, takže vzniklý hybrid měl dvakrát více chromozómů než každý z rodičů a tedy také dvakrát větší dědičnou informaci. Jen pro úplnost, dědičná informace rostlin i živočichů není tvořena jedinou molekulou DNA, ale je rozdělena na části, které nazýváme chromozómy. Potomek křížení obvykle dostává vždy po jedné sadě chromozómů od každého z rodičů a má tedy sady dvě. Organismus, jenž má více než dvě sady chromozómů, označujeme jako polyploidní.
Kříženec obou planých druhů trav měl čtyři sady chromozómů a byl tudíž tetraploidní. Takto vzniklý nový druh (Triticum dicoccoides Körn.) byl planým předchůdcem současné pšenice tvrdé (Triticum durum Desf.), která se používá zejména pro přípravu kvalitních těstovin a kuskusu. Další křížení nastalo asi před 10 tisíci lety v mladší době kamenné, kdy se již jmenovaný předchůdce pšenice tvrdé zkřížil s třetím planým druhem trávy, Aegilops tauschii Coss. Křížení dalo vzniknout předchůdci současné pšenice seté. Stojí za povšimnutí, že toto křížení nastalo v oblasti úrodného půlměsíce v období vznikajícího zemědělství; vznik pšenice seté je tedy těsně spjat se změnou způsobu života našich předků a vznikem prvních civilizací. Tento vztah byl tak těsný, že planou pšenici setou neznáme a zdá se, že vždy existovala jen jako druh pěstovaný člověkem. Je důležité, že ani toto druhé křížení se neuskutečnilo standardně a potomek – přímý předchůdce pšenice seté – opět získal všechny sady chromozómů obou rodičů a měl jich tedy šest! Znamená to, že jeho dědičná informace byla třikrát větší než dědičná informace kteréhokoli z jeho tří původních rodičů. A to je důvod, proč je dědičná informace současné pšenice seté tak velká a představuje ji asi 17 miliard bází DNA. Je téměř šestkrát větší než dědičná informace člověka, čtyřicetkrát větší než dědičná informace rýže a více než stokrát větší než dědičná informace modelové rostliny Arabidopsis thaliana.
Vzhledem k obrovské kapacitě současných sekvenátorů by samotná velikost dědičné informace tolik nevadila v případě, že by se každý její úsek v genomu vyskytoval pouze jednou. Jenže u pšenice je takových úseků DNA pouze asi jedna setina a téměř veškerá dědičná informace je tvořena různě dlouhými motivy, které se vyskytují v mnoha kopiích a variantách. A jak již víme, ke všemu se dědičná informace pšenice skládá ze tří podobných souborů sekvencí DNA pocházejících od tří rodičovských druhů. Na velký problém je tak zaděláno. Všechny současné metody sekvenování poskytují krátká čtení o délce pouhé stovky až tisíce bází, což je málo pro jejich sestavení ve větší úseky a získání úplné dědičné informace. Situace by byla jednodušší, kdybychom dědičnou informaci mohli číst po menších částech a byli bychom schopni oddělit dědičnou informaci získanou od každého ze tří rodičů. Tím bychom alespoň částečně odstranili potíže s přítomností většího množství navzájem si podobných úseků DNA, jejichž polohu v genomu nejsme schopni jednoznačně určit.
Obr. 2 – Průtokový cytometr. Detail průtokové komůrky, ve které se mikroskopické částice pohybují za sebou v úzkém vodním proudu a interagují s paprskem laseru.
Taková možnost naštěstí existuje. Tým prof. Jaroslava Doležela v olomouckém pracovišti Ústavu experimentální botaniky AV ČR vypracoval metodu, jejíž pomocí lze izolovat jednotlivé chromozómy pšenice. Využívá se k tomu průtoková cytometrie – metoda analyzující optické vlastnosti mikroskopických částic, především rozptyl světla a fluorescenci. Její výhodou je možnost analyzovat velké populace mikroskopických objektů rychlostí tisíce částic za vteřinu a také velkou rychlostí izolovat (třídit) subpopulace měřených částic s určitými vlastnostmi (obr. 2). Průtoková cytometrie nachází hlavní uplatnění v biomedicínském výzkumu a klinické praxi, především při identifikaci a třídění různých typů buněk. Její využití pro třídění chromozómů rostlin je unikátní a olomoucká laboratoř ÚEB je jediná na světě, kde se tato metoda rutinně používá. Metody třídění chromozómů zde vědci postupně vypracovali pro více než 20 druhů rostlin včetně pšenice. Pro plné využití možností, které třídění chromozómů nabízí, bylo důležité, že také vypracovali postupy využití DNA izolovaných chromozómů v genomice. Odtud chromozómová genomika (obr. 3).
Obr. 3 – Princip chromozómové genomiky. Vodní suspenze izolovaných chromozómů je analyzována průtokovým cytometrem a vybraný chromozóm je velkou rychlostí tříděný do zkumavky. Takto získaná frakce představuje menší část genomu a její analýza je podstatně jednodušší, než pokud by byl analyzován celý genom. V případě pšenice seté, která získala 7 párů chromozómů od každého ze tří rodičů (na obrázku označené A, B a D) a má tedy 21 různých chromozómů, nabízí tento přístup značné zjednodušení a zpřesnění všech analýz.
V letech 2003–2005, kdy Mezinárodní konsorcium pro sekvenování genomu pšenice (International Wheat Genome Sequencing Consortium – IWGSC) připravovalo svou strategii, mohla olomoucká laboratoř nabídnout postup, který byl dokonalejší alternativou ke standardní metodě celogenomového sekvenování, kdy se sekvenuje DNA izolovaná z celého genomu. Výhody chromozómové genomiky převážily a konsorcium si ji zvolilo jako výchozí metodu. Tím se olomoucká laboratoř ÚEB stala klíčovým členem mezinárodního konsorcia. Třídění chromozómů nabídlo možnost rozdělit obrovskou a složitou dědičnou informaci na menší části. Zároveň však poskytlo unikátní možnost koncipovat mezinárodní projekt způsobem, při němž každý člen konsorcia sekvenuje jasně definovanou část (chromozóm), a tak na projektu může paralelně pracovat mnoho laboratoří v různých částech světa. Podtitul na obálce již zmíněného čísla časopisu Science „Krájení genomu pšenice“ tak dobře vystihuje zvolenou strategii.
Jaký je současný stav odhalování tajemství dědičné informace pšenice a o čem časopis Science v červenci referoval? Zásadní pokrok představuje sestavení „genetického plánu“ pšenice. DNA izolovaných chromozómů pšenice je sice sekvenována, ale bez ambice sestavit úplnou (referenční) sekvenci genomu. Cílem bylo pokud možno rychle získat představu o molekulární struktuře každého z 21 chromozómů, což se podařilo. Členové konsorcia mj. identifikovali přes 124 tisíc genů této plodiny (člověk jich má jen asi 22 tisíc) a určili jejich přibližné pořadí na chromozómech. Znalost genů a jejich umístění velmi usnadní vývoj markerů pro šlechtění a izolaci důležitých genů. Zároveň je poprvé možné podrobně studovat změny dědičné informace, které doprovázely evoluci pšenice, její domestikaci a šlechtění. Lze například zjišťovat, které geny rodičovských druhů byly zachovány, které byly různými mechanismy změněny či dokonce inaktivovány a které byly naopak zkopírovány na jiné místo v genomu.
Prostřednictvím nově získaných sekvencí chromozómů pšenice a znalostí alespoň částečných sekvencí většiny jejich genů bylo možné podrobně analyzovat fylogenezi pšenice. Získané výsledky naznačují, že dva již zmíněné rodičovské druhy pšenice, Triticum urartu a druh podobný současnému druhu Aegilops speltoides, se oddělily od společného předka asi před sedmi miliony let. Překvapující je zjištění, že se tyto dva druhy asi před 1–2 miliony let křížily a daly vzniknout třetímu rodiči pšenice, druhu Aegilops tauschii. Znamená to, že fylogeneze pšenice byla ještě složitější, než jsme předpokládali, a že současná pšenice setá vznikla jako výsledek mnoha opakujících se křížení a zdvojování dědičné informace.
Obr. 4 – Část fyzické mapy krátkého ramene chromozómu 3D pšenice. Detail souboru překrývajících se klonů DNA o velikosti přes 100 tisíc bází DNA, které byly uspořádány tak, aby to odpovídalo jejich pořadí na chromozómu. Červeně zbarvené klony představují minimální sestavu klonů pokrývajících daný úsek chromozómu, která byla vybrána pro sekvenování.
Znalost genů pšenice včetně jejich umístění v genomu umožňuje studovat, jak geny tří původních rodičů, které jsou nyní součástí dědičné informace pšenice seté, spolupracují (jsou zapínány a vypínány) v průběhu růstu a vývoje organismu, jeho orgánů a pletiv. Jde o biologicky podnětné téma a jeho studium nepochybně přinese zásadní poznatky o mechanismech, které řídí tyto interakce, a také odpoví na otázku, proč bylo mezidruhové křížení a zdvojování dědičné informace v evoluci rostlin tak úspěšné. Člověka zajímá především pšeničná obilka, z jejíhož živného pletiva (endospermu) se připravuje mouka. Analýza exprese genů všech tří rodičů odhalila složité interakce rodičovských genomů, kdy se aktivita genů jednotlivých rodičů mění v závislosti na typu pletiva obilky a jeho vývojovém stadiu. Vedle obecného významu jsou tyto poznatky zásadní pro šlechtění odrůd pšenice se zvýšeným výnosem i kvalitou.
Konečným cílem Mezinárodního konsorcia pro sekvenování genomu pšenice je získat co nejúplnější, tj. referenční sekvenci genomu. Významným milníkem na cestě k tomuto cíli je referenční sekvence prvního z jejích 21 chromozómů – chromozómu 3B. Písmeno B znamená, že tento chromozóm pochází z neznámého rodiče pšenice, kterému je blízký druh Aegilops speltoides. Chromozóm 3B je největší chromozóm pšenice o velikosti asi 900 milionů bází. To je zhruba dvakrát více než celý genom rýže a šestkrát více než celý genom Arabidopsis thaliana. Důvod, proč byl tento velký chromozóm zvolen za model, na kterém se ověřují nové metody a postupy, byl prozaický – pomocí průtokové cytometrie jej lze velmi snadno třídit. Strategie sekvenování zahrnovala konstrukci tzv. fyzické mapy, tj. souboru klonů DNA o průměrné velikosti přes 100 tisíc bází uspořádaných, jak to odpovídá jejich pořadí na chromozómu (obr. 4). Tyto klony (bylo jich celkem 8452) byly po menších skupinách sekvenovány. Výsledkem jsou mj. velmi podrobné informace o molekulární struktuře chromozómu 3B, identifikace jeho 5326 genů kódujících proteiny a také 1938 pseudogenů (nefunkčních kopií genů). Významná je informace o distribuci genů podél chromozómu, jejichž uspořádání není náhodné, a též nové poznatky o vztahu mezi molekulární strukturou chromozómu a distribucí rekombinací v průběhu meiózy. Není pochyb, že referenční sekvence chromozómu 3B urychlí izolaci důležitých genů a pomůže objasnit, jak struktura genomu ovlivňuje vlastnosti rostliny.
Mezinárodní konsorcium pro sekvenování genomu pšenice plánuje dokončení referenčních sekvencí zbývajících dvaceti chromozómů do konce roku 2017. Významnou úlohu bude i nadále hrát olomoucká laboratoř ÚEB, která z tříděných chromozómů připravila soubory klonů DNA, s jejichž pomocí členové konsorcia sestavují fyzické mapy „svých“ chromozómů. Sama také sestavuje referenční sekvence ramen chromozómů 3D a 7D a celého chromozómu 4A. Pokud se podaří ambiciózní cíl konsorcia splnit, budeme svědky pozoruhodné situace, kdy bude sekvence obrovského genomu pšenice kvalitnější než sekvence mnoha jiných rostlin s menšími genomy, kde se upřednostnilo technicky jednodušší celogenomové sekvenování. O významu referenční sekvence pšenice pro šlechtění a zvyšování výnosu a kvality nelze pochybovat, a tak má genomika pšenice šanci přispět k odvrácení rizika nedostatku potravin. Dostupnost kvalitní sekvence genomu může také z pšenice udělat modelový systém pro studium mechanismů vzniku nových druhů rostlin hybridizací a polyploidizací i pro studium funkce genomů takto vzniklých druhů, a to vše navzdory její velké a složité dědičné informaci. Zdá se tedy, že časopis Science vsadil na správnou kartu, když letos analýze genomu pšenice věnoval takovou pozornost.
JAROSLAV DOLEŽEL,
Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i.,
a Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Olomouc