English
V loňském říjnovém čísle Akademického bulletinu jsme podrobněji představili tzv. PPP Program, v jehož rámci Německá akademická výměnná služba (Deutscher Akademischer Austauschdienst – DAAD) financuje mobilitní projekty s partnerskými organizacemi z necelé třicítky zemí. Spolupráci AV ČR s DAAD jsme shrnuli za 10 dvouletých období, jež byla realizována od spuštění programu před deseti lety (2004–2005 až 2013–2014). Další část článku představila vybrané projekty z I. vědní oblasti (ASÚ).
Projekty z I. a II. vědní oblasti byly v uvedeném období zastoupeny stejnou měrou (shodně po 36 – 48 %), z III. vědní oblasti získaly podporu tři (4 %). Dosud nejúspěšnější byla sekce matematiky, fyziky a informatiky (30 projektů), následují všechny sekce z II. vědní oblasti – v biologických a lékařských vědách se uskutečnilo 20 projektů, chemické vědy zastupovalo 11 projektů, pět připadlo na vědy biologicko-ekologické.
Mezi 25 pracovišti AV ČR, která v daném období získala finanční podporu pro 75 projektů, jednoznačně převládá Fyzikální ústav se 14 projekty (19 %). Pracoviště II. vědní oblasti patřila co do počtu uskutečněných projektů na přední místa – po sedmi (9 %) realizovaly Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského a Mikrobiologický ústav, Ústav experimentální botaniky uskutečnil projektů pět (7 %).
Tentokrát představíme projekty ze dvou pracovišť II. vědní oblasti – ředitele Mikrobiologického ústavu dr. Martina Bileje a dr. Sergeye Filippova z Ústavu makromolekulární chemie, kteří dlouhodobě spolupracují s partnerskými pracovišti v Německu; dr. Bilej v rámci PPP Programu realizoval již dva projekty, v případě dr. Filippova jde o první.
Přirozená slizniční imunita kroužkovců a členovců
Bezobratlí představují v imunologii důležité modelové organismy, které se zasloužily o nové a významné objevy, jako jsou fagocytóza nebo charakterizace skupiny Toll receptorů; shodou okolností byly oba zmíněné objevy oceněny Nobelovou cenou (Ilja I. Mečnikov – 1908, Jules A. Hoffmann – 2011). Množství druhů bezobratlých úspěšně přežívajících dlouhé evoluční období je ve srovnání s poměrně nízkým počtem obratlovců ohromující. Studium obranných strategií bezobratlých může pomoci k porozumění ekologických vztahů souvisejících zejména s úlohou bezobratlých jako přenašečů chorob, zemědělských škůdců, zdroje potravin nebo indikátorů environmentálních rizik.
Foto: Archiv MBÚ AV ČR
Žížala Eisenia andrei
Projektem řešeným naší skupinou srovnávací imunologie z Laboratoře buněčné a molekulární imunologie MBÚ s německými kolegy z Justus-Liebig Universität v Giessenu jsme pokračovali v dlouhodobé spolupráci. Jejím základem se staly individuální výměnné pobyty se skupinou doc. Ellen Kauschke z Ernst-Moritz-Arndt Universität v Greifswaldu a následně první společný projekt v Programu vědeckých výměn věnovaný charakterizaci kalretikulinu u kroužkovců (2004–2005). Spolupráce pokračovala i poté, co se doc. Kauschke přestěhovala do Giessenu, kde se k projektu pro období 2012–2013 připojila prof. Martina Trenczek a obohatila jej o další modelový organismus, lišaje Manduca sexta.
Foto: Achiv MBÚ, AV ČR
Histologický obraz příčného řezu střevem žížaly
Volba zástupců kroužkovců a členovců má své opodstatnění. Vedle fylogenetických, anatomických a dalších rozdílů se obě skupiny liší svým mikrobiálním prostředím. Žížaly E. andrei patří mezi tzv. epigeické druhy a žijí v kompostu nebo vrstvě rozkládající se biomasy – tedy v prostředí silně kolonizovaném mikrobiálními společenstvy. Kompost obsahuje stokrát více bakterií než půdní substrát. Uvádí se, že trávicím traktem žížal E. andrei projde denně přibližně stejné množství substrátu, jako je hmotnost žížaly, což znamená, že mukózní povrch střeva je vystaven nejméně 10 milionům bakterií denně. Mikrobiální složení ve střevě není identické se zastoupením mikroorganismů v prostředí a žížaly si ve střevě udržují specifickou mikrobiotu. Celosvětově se zpracování bioodpadu a vermikompostování zvyšuje; bioodpad přitom může obsahovat i živočišnou složku často kontaminovanou patogeny. Například Escherichia coli O157:H7 je patogenní kmen asymptomatický pro hospodářská zvířata, ale způsobuje vážné zdravotní potíže u člověka (Hutchinson et al., Lett. Appl. Microbiol. 39, 207–214, 2004). Žížaly, které tolerují bakterie patogenní pro obratlovce, tak mohou přispět k jejich přenosu a rozšíření. Z tohoto hlediska je poznání mechanismů fungování slizniční imunity u žížal důležité.
Foto: Archiv MBÚ AV ČR
Housenky lišaje Manduca sexta (zelená housenka je krmena přirozenou potravou, modrozelená barva je důsledkem laboratorní diety).
Životní prostředí hmyzu obsahuje obecně méně mikroorganismů, s čímž souvisí i nižší kolonizace střeva. Například ze střeva drozofily izolovali badatelé přibližně třicet bakteriálních druhů, což je řádově méně ve srovnání s jinými živočichy (Erkosar et al., Cell Host Microbe 13, 8–14, 2013). Podobně je tomu i u dalšího modelového druhu použitého v našem projektu, u lišaje Manduca sexta, významného škůdce tabáku. Je známo, že střevním patogenem hmyzu je Bacillus thuringiensis kurstaki, jehož toxiny se často používají pro biologickou ochranu proti škůdcům. Mikroorganizmus vstupující do hostitelského organismu musí překonat epiteliální bariéru. Jakým způsobem se tak děje a co určuje, zda bude či nebude patogenní, není zatím uspokojivě vysvětleno. Naše srovnávací studie přirozené slizniční střevní imunity při infekci, respektive patogenní zátěži při příjmu potravy profitovala z možnosti využití obou zmíněných modelových druhů, žížal Eisenia andrei a housenek lišaje Manduca sexta. Střevo je na jedné straně potenciálním místem infekce, na straně druhé představuje důležitý imunokompetentní orgán, jenž produkuje enzymy, antimikrobiální peptidy a regulační faktory ovlivňující migraci imunocytů do místa zánětu.
Při řešení projektu jsme využili zkušenosti pražské skupiny s molekulárně biologickými přístupy a zkušenosti německé skupiny se studiem struktury a funkce. U obou modelových druhů jsme sledovali expresi a aktivity imunologicky významných molekul (lysozym, receptory rozpoznávající molekulární vzory – tzv. pattern recognition receptors – CCF, PGRP-1A, IML-3, TLR, scolexin) ve střevě a dalších tkáních jak in situ hybridizací, tak kvantitativní RT-PCR, a to zejména v souvislosti s podáním bakterií v potravě. Podařilo se nám zmapovat kinetiku odpovědi po podání bakterií a navrhnout předpokládaný model přirozené imunitní odpovědi. Výsledky jsme prezentovali na vědeckých setkáních, shrnuty budou ve dvou impaktovaných článcích. Projekt byl vedle odborného přínosu a podpory mobility důležitý zejména pro zúčastněné studenty doktorských studijních programů (Jiří Dvořák, František Škanta, Christoph-Rüdiger von Bredow a Yvette M. Kühnel), kterým pomohl získat zahraniční zkušenosti a osvojit si nové experimentální techniky.
Makromolekulární nanočástice s cholesterolem pro směrování do pevných nádorů
Makromolekulární nanočástice lze zařadit mezi nejperspektivnější nosiče léčiv. Moderní medicína používá pro léčbu nádorových onemocnění převážně nízkomolekulární léčiva. Jejich použití vede k vedlejším účinkům, které často zapříčiní částečné poškození zdravých tkání a orgánů. Hlavním cílem projektu, který realizujeme v letech 2013–2014, je vyvinout klinicky orientovaná polymerní léčiva připravená na bázi kopolymeru N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) nesoucího různá protinádorová léčiva (doxorubicin, dexamethason či paclitaxel), která se váží k polymernímu skeletu nosiče hydrolyticky štěpitelnou kovalentní vazbou. HPMA kopolymer (PHPMA) obsahuje různé množství cholesterolových skupin umožňujících tvorbu polymerních nanočástic. Tvorba nanočástic a jejich chování, především ve vodných roztocích, se studují prostřednictvím mnoha metod – například využívajících rozptylu světla (SLS/DLS) či neutronů (SANS), dále fluorescence (FCS) a mikroskopie (AFM). S pomocí kombinace doplňkových fyzikálních metod se model nanočástic HPMA kopolymer-cholesterol studuje bud’ s, nebo bez protinádorových léčiv. V průběhu řešení projektu určíme klíčové parametry, které ovlivňují strukturu a funkčnost nanočástice. Na základě této znalosti lze specificky vybírat a syntetizovat systémy, které mají největší potenciál na úspěch jako nanočásticové nosiče léčiv.
Obr. 1
Schéma spolupráce a koordinace projektu
Na řešení projektu se podílejí dvě vědecké skupiny s komplementární znalostí nanočásticových systémů: skupina dr. Christine M. Papadakis z Technické univerzity v Mnichově a skupina dr. Sergeye Filippova z ÚMCH. Každá skupina má specifické přístrojové vybavení a znalosti, které se navzájem doplňují, což je silnou stránkou projektu (obr. 1).
FCS měření se provádí na Technické univerzitě v Mnichově, SANS a časové rozlišené SANS měření na FRM-II reaktoru v Garchingu.
Ve spolupráci s oddělením Biolékařských polymerů ÚMCH (prof. Karel Ulbrich) jsme provedli syntézu hydrolyticky labilních konjugátů PHPMA s cholesterolem a s protinádorovým antibiotikem doxorubicinem navázanými na PHPMA nosič pomocí pHsenzitivní hydrazonové vazby. To znamená, že v těchto konjugátech jsou deriváty cholesterolu a léčivo připojeny k PHPMA nosiči pHštěpitelnou vazbou zajišťující stabilitu systému v průběhu transportu organismem (krví, pH 7,4), uvolnění plně aktivního léčiva a rozpad nosiče v nádoru a cílové nádorové buňce (pH < 6). V nádoru se polymerní konjugát ukládá přednostně proto, že PHPMA vytváří ve vodných roztocích nanočástice, které jsou kvůli své velikosti ve většině pevných nádorů, na rozdíl od zdravých tkání, zachytávány přednostně na základě EPR efektu.
Roztokové chování studovaných systémů je v projektu charakterizováno pomocí maloúhlového rozptylu neutronů (SANS) a rentgenového záření (SAXS). Ve spolupráci obou participujících pracovišť byla provedena komplexní charakterizace konjugátů PHPMA. Na pracovišti ÚMCH se uskutečnila studie velikosti polymerních micel pomocí rozptylu světla a s externí podporou EMBL (Hamburk, Německo), jakož i studie rozptylu rentgenového záření. Dále byly pomocí maloúhlového rozptylu neutronů na reaktoru FRM II v Mnichově změřeny časové průběhy změn velikostí micel indukované změnou pH roztoku. Detailně jsme již prostudovali vnitřní strukturu a vlastnosti těchto nanočástic v rozsahu pH 5,0–7,4; zjistili jsme, že molekulární struktura hydrazonové spojky a hydrofobnosti derivátů cholesterolu mají významný vliv na velikost micely (poloměru) a na její další osud po změně pH (obr. 2).
Obr. 2
Schematická chemická struktura polymerních konjugátů s léčivem, hypotetický model nanočástic složených z těchto konjugátů před a po snížení pH.
Pro ÚMCH představuje významný výsledek spolupráce rovněž měření provedená na TUM, při nichž byly stanoveny kritické micelární koncentrace roztoků konjugátů PHPMA s cholesterolem metodou fluorescenční korelační spektroskopie (FCS). Poznatky vyplývající z výsledků měření dále využijeme při zprovoznění moderního konfokálního mikroskopu, který byl v ÚMCH nově pořízen na konci roku 2013.
Získané zkušenosti již byly aplikovány na studium fyzikálně-chemických vlastností dalších konjugátů PHPMA syntetizovaných v oddělení Biolékařských polymerů ÚMCH a určených pro cílenou léčbu nádorových onemocnění.
V roce 2014 dokončujeme detailní studii konjugátů PHPMA s cholesterolem a s protinádorovým léčivem doxorubicinem vázanými pHsenzitivní hydrazonovou vazbou. Půjde jak o polymerní konjugáty připravené již v roce 2013, tak konjugáty připravené „na míru“ na základě poznatků získaných během prvního roku výzkumu. Konjugáty budou obsahovat deriváty cholesterolu i doxorubicin vázané hydrazonovou vazbou; navíc budeme syntetizovat a studovat i konjugáty s dalšími kancerostatiky – například paclitaxelem. Nadále se bude podrobně studovat vnitřní struktura částic složených z takových konjugátů s cílem získat poznatky pro návrh struktury a syntézu vysoce účinných protinádorových léčiv.
JANA VLACHOVÁ,
Kancelář Akademie věd ČR,
MARTIN BILEJ,
Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i.,
SERGEY FILIPPOV, KAREL ULBRICH, PETR CHYTIL,
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.