Kompozity na bázi kolagenových/želatinových nanovláken aneb Nehodící se škrtněte

 

Všechna fota: Archiv ÚSMH AV ČR
Nanokompozitní nosič tvořený polylaktidovými nanovlákny, kolagenovou matricí a bioapatitovými nanočásticemi. Zleva: makrosnímek, SEM snímek, mikro-CT snímek.

 

Materiálový výzkum získal nový impulz poznáním možností, jež vyplývají ze specifických vlastností materiálů v jejich submikronové formě – nanočástic a nanovláken. Kvůli velkému poměru povrchu a objemu se mohou tyto nanomateriály projevovat novými, ještě nepoznanými vlastnostmi a novými aplikačními možnostmi v paletě oborů – například v oblasti biomateriálů. Nanočástice a nanovlákna nachází uplatnění také ve vícesložkových materiálech, kompozitech, které využívají synergické inter­akce dvou či více materiálových složek (matrice a výztuže) k dosažení nových vlastností převyšujících prostý součet příspěvků přítomných složek. Právě z důvodu objevování nových technologických a materiálových možností zažívá výzkum materiálů v novém tisíciletí neobyčejný rozvoj. Podstatným důvodem je skutečnost, že aplikace výztuže kompozitů v jejich nanovlákenné nebo nanočásticové formě mohou mít lepší fyzikálně-mechanické vlastnosti než jejich mikronové analogy.

Inspirací pro tyto úvahy může být právě kost, protože je příkladem přírodního nanokompozitu, a to vláknového i částicového. Obsahuje přibližně 60 hmotnostních procent (% hm.) anorganické fáze na bázi kalcium fosfátu, 20 % hm. kolagenu, 9 % hm. vody, dále neko­lagenní bílkoviny, sacharidy, lipidy a kostní buňky (osteoblasty), které produkují mezibuněčnou hmotu. Krystaly kalcium fosfátu jsou vázány na kolagenní nanovlákna.

 

Nanočástice kalcium fosfátů; biopatit izolovaný z hovězí kosti (vlevo),
kalcium deficientní hydroxyapatit připravený precipitací (vpravo).
 

Naše pracoviště se ve spolupráci zejména s Oddělením biomateriálů a tkáňového inženýrství Fyziologického ústavu AV ČR, Laboratoří buněčné regenerace a plasticity Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR a Laboratoří biomechaniky Ústavu mechaniky, biomechaniky a mechatroniky Fakulty strojní ČVUT v Praze zabývá přípravou nanokompozitních porézních materiálů pro aplikaci v kostním tkáňovém inženýrství. Lze je definovat jako biomimetické materiály. Označení „biomimetický“ je odvozeno z řeckých slov bios znamenající život a mimesis – imitace. Implantáty tedy imitují reálný biologický systém ať už složením, strukturou nebo procesem, kterým byly připraven.

Tyto nosiče musí v optimální míře vykazovat funkčnost specifických biologických tkání, která umožňuje jejich obnovu. Jinými slovy, nesmí být toxické a imunogenní, musí být biokompatibilní s danou tkání, vykazovat vhodnou míru biodegradability, mechanické vlastnosti a také odpovídající porozitu a morfologii pro transport buněk, živin, signálních molekul, plynů a metabolických produktů. Před plánovanou operací mohou být implantáty kolonizovány pacientovými vlastními buňkami, odebranými biopticky a namnoženými v podmínkách buněčné kultury. Lze použít i mesenchymální kmenové buňky, u nichž je možné navodit diferenciaci v osteoblasty. V ideálním případě by materiál měl být pouze dočasným degradabilním nosičem s postačujícími mechanickými vlastnostmi pro počáteční osídlení buňkami, než buňky začnou produkovat vlastní nosnou funkční mezibuněčnou hmotu a dokud nedojde k remodelaci poškozené kostní tkáně. U degradabilních materiálů lze poté očekávat jejich úplné nahrazení regenerovanou a funkční kostní tkání.

 

Lyofilizáty kolagenu izolovaného z různých živočišných druhů, kuře (vlevo), kráva (vpravo)
 

V našem případě jde o kolagen ve formě vláken nebo matrice a bioapatit (kalcium fosfát) jako plnivo. Bio­apatit a kolagen se izolují z biogenních zdrojů za účelem maximálního přiblížení struktuře a vlastnostem v jejich přirozené formě. ­Jejich chemické a fyzikální vlastnosti se přitom mohou lišit v závislosti na živočišném druhu, z něhož se izolují. Lze použít také syntetické degradovatelné polymery jako například polylaktidy a jejich kopolymery, u nichž je možné volbou molekulové hmotnosti a krystalinity ovlivňovat dobu a rychlost degradability. Kolagen představuje podstatnou část (až 30 %) všech bílkovin v organismu; je hlavní organickou složkou kostí, chrupavek, šlach, vaziva, kůže a dalších tkání, klíčovou roli sehrává jako složka mezi­buněčné hmoty. Do současnosti se identifikovalo a popsalo 28 typů kolagenu, v lidském těle nejrozšířenějším (až 90 %) je kolagen typu I. Charakteristickou vlastností molekuly kolagenu je trojřetězcová helikální struktura (šroubovice), která mu poskytuje výjimečné mechanické vlastnosti. Avšak vlivem chemického, tepelného nebo radiačního působení se mění jeho nativní vlastnosti (degradace šroubovice na kvarterní, terciální nebo molekulární úrovni).

 

Materiály připravené elektrostatickým zvlákňováním z kolagenového prekurzoru (izolovaného z kůže třeboňského kapra) s různými parametry. Při zvlákňování roztoků s nízkou viskozitou dochází k elektrostatickému rozprašování, tzv. electrospraying (A). Vysoké povrchové napětí a nižší viskozita roztoku způsobuje vznik tzv. korálkových defektů (B).
Ukázka submikronových vláken z roztoku kolagenu s optimálními parametry (C).

 

Pro přípravu kolagenových nanovláken se v současnosti za nejperspektivnější považuje metoda elektrostatického zvlákňování, tzv. electrospinning, která se již nějakou dobu používá pro přípravu nanovláken z organických a anorganických látek. Pro zpracování se využívá vysokého stejnosměrného napětí mezi tryskou roztoku nebo taveniny vysokomolekulární látky a sběrnou elektrodou k vytvoření urychleného nabitého proudu kapek roztoku, ze kterých vystřelují směrem ke sběrné elektrodě nanovlákna z exponované látky. Před dopadem na sběrnou elektrodu se rozpouštědlo odpaří a na elektrodě jsou deponována polymerní nanovlákna. Vlastnosti takto připravených nanovláken (rozměry, orientace, porozita, přítomnost iregularit atd.) lze ovlivňovat mnohými parametry jak procesu zvlákňování samého, tak parametry zvlákňovaného roztoku. Proměnných lze vypočítat až třicet, patří mezi ně například vzdálenost elektrod, napětí, vlhkost a teplota prostředí a také specifické vlastnosti polymeru ve vhodném rozpouštědle, jako jsou jeho molekulová hmotnost, viskozita roztoku, povrchové napětí, parametr rozpustnosti, elektrická vodivost roztoku, dielektrické vlastnosti atd.

Lze konstatovat, že elektrostatické zvlákňování polymerů s jednoduchou makromolekulární strukturou, jako jsou například polyvinylalkohol nebo polylaktid s optimální molekulovou hmotností, které snadno vytváří roztok o koncentraci okolo 10 % hm., není složité. V případě kolagenu, citlivého, lehce degradovatelného polymeru, je situace podstatně složitější. Převedení kolagenu do roztoku se uskutečňuje v prostředí buď zvýšené koncentrace kyseliny octové, nebo specifických rozpouštědel například ze skupiny fluoroalkoholů. Při převádění do roztoku se totiž musí rozrušit kvartérní struktura kolagenu a umožnit tak jeho jednotlivým trojitým šroubovicím, aby se v roztoku rozptýlily. Jakmile je však šroubovice poškozena, což se u kolagenu snadno stává, dochází ke ztrátě jeho struktury a tím i unikátních biologických vlastností.

 

3D reprezentativní rekonstrukce mikro-CT řezů nanokompozitním nosičem se vzájemně propojenými mikropóry.

 

V současnosti tedy stále zůstává otázkou, zda po všech provedených operacích s kolagenem (izolace, skladování, opětné rozpouštění a podrobení kolagenu vysokému napětí při zvlákňování), zůstává zachována jeho nativní struktura, anebo je již více méně zdenaturován do želatiny. Tuto míru denaturace lze jak kvalitativně, tak i kvantitativně stanovit několika analytickými metodami jako například elektroforézou, diferenční skenovací kalorimetrií, infračervenou spektroskopií, cirkulárním dichroismem či optickými technikami s využitím generace druhé harmonické. Otázku denaturace kolagenu vtipně glosuje například název publikace Zeugolise a kol.: Electro-spinning of pure collagen nano-fibres – Just an expensive way to make gelatin?.