English
V Akademickém bulletinu otiskujeme článek doc. Ady Kolmanové, která tři desetiletí působila na Stockholmské univerzitě, kde se zabývala radiační biologií, toxikologií a molekulární biologií. V letech 2005–2009 mj. participovala na evropském projektu ACuteTox (Research Project for Alternative Testing). Je členkou vědecké rady švédského Fondu Vědecký výzkum bez použití pokusů na zvířatech (www.forskautandjurforsok.se). Článek podává přehled o přínosu významného švédského vědce Björna Ekwalla (1940–2000) pro vývoj testování toxických chemikálií s účelem nahradit experimenty na zvířatech alternativními testy. Jedním z úkolů Fondu Björna Ekwalla (BEMF) je podpořit vědce, kteří přispívají k rozvoji buněčné toxikologie.
Foto: Archiv autorky
Spoluzakladatel Skandinávské společnosti pro buněčnou toxikologii Björn Ekwall
Současný vývoj buněčné toxikologie do značné míry ovlivnila průkopnická práce švédského buněčného toxikologa doc. Björna Ekwalla (1940–2000), který vystudoval a obhájil doktorskou práci na Uppsalské univerzitě. V roce 1983 tam založil Cytotoxikologickou laboratoř; o šest let později se stal docentem a pracoval tam až do roku 1996. Již v disertační práci se zabýval testováním toxických látek na buněčných kulturách a pokusil se vyhodnotit, zda buněčná toxicita může predikovat toxické účinky na lidský organismus. Výsledky výzkumu ukázaly, že buněčné kultury mají schopnost do značné míry nahradit pokusy na zvířatech. V roce 1983 vyslovil novou hypotézu, kterou nazval „koncepce bazální cytotoxicity“.
Podle uvedené hypotézy je poškození chemickými látkami v důsledku zásahu do základních buněčných struktur a funkcí (např. buněčné dělení, metabolismus, syntéza a degradace nejdůležitějších buněčných komponent, integrita buněčných membrán apod.) společné pro všechny savčí, tedy i lidské buňky. Vzhledem k této identické bazální cytotoxicitě lze buněčné kultury používat pro určování a predikci toxicity chemických látek u lidí. B. Ekwall definoval i jiné typy toxicity – například takzvanou orgánově-specifickou toxicitu, kdy chemická látka vykazuje toxický účinek na specifický orgán (např. na nervovou soustavu, játra, ledviny atd.). I tento typ toxicity lze testovat na kultivovaných buňkách; v tomto případě je ovšem třeba testy provádět na buněčných liniích nebo tkáních odvozených z těchto orgánů.
Testováni toxických látek na buněčných kulturách je výhodné i z jiných hledisek. Ušetří se velký počet experimentálních zvířat při pokusech, které jsou často drastické. Takzvané alternativní testy na kultivovaných buňkách jsou z etického hlediska mnohem přijatelnější, rychlejší, efektivnější i ekonomičtější. Navíc, alternativní testy, obzvláště prováděné na lidských buňkách, jsou průkaznější i z vědeckého hlediska, protože toxický účinek chemických látek více odpovídá tomu, co se ve skutečnosti odehrává v lidských buňkách, což může být odlišné od situace u jiných živočišných druhů (myši a potkani).
V době, kdy B. Ekwall formuloval hypotézy, se testy na buněčných kulturách používaly ve velmi omezené míře, a to hlavně proto, že relevantnost alternativních testů pro člověka nebyla systematicky studována a vědecky vyhodnocena. V roce 1989 proto B. Ekwall zahájil mezinárodní projekt spolupráce pod názvem MEIC (Multicentre Evaluation of In Vitro Cytotoxicity Programme), v němž byl toxický účinek 50 chemických látek vyhodnocován pomocí 61 různých testů, a to v několika desítkách laboratoří na celém světě. Jako referenční systémy použil nejen hodnoty LD50 (letální dávka vyvolávající 50% úmrtnost u experimentálních zvířat), ale také poprvé jím zavedenou hodnotu LC50, která znamená 50% přežití u lidí. Poslední hodnota představuje koncentraci toxické látky v krvi osob, které se otrávily (úmyslně nebo neúmyslně) s letálními důsledky. Koncentrace toxických látek byly získány z klinických a soudních údajů nebo z vědeckých publikací. B. Ekwall a jeho kolegové dokázali vytvořit rozsáhlou databázi pro více než 50 toxických látek, u nichž byly známy koncentrace v krvi po otravě jak v případě letálního důsledku, tak přežití. Zmíněná databáze má význam i v současnosti, přičemž data se používají též v jiných databázích.
Projekt MEIC trval do roku 1998 a lze jej hodnotit jak velmi úspěšný: prokázal, že testování na buněčných kulturách, zejména na lidských buňkách, přináší lepší výsledky než testy na zvířatech. Avšak ukázalo se, že jeden test nestačí, a proto byly vybrány tři testy vykazující nejlepší výsledky. Na druhou stranu se potvrdilo, že u některých chemických látek lze jen těžko předpovědět toxický účinek, protože chybí orgánově-specifické testy. V roce 1999 proto B. Ekwall rozpracoval další mezinárodní projekt – EDIT (Evaluation-guided Development of In Vitro Toxicity and Toxicokinetic Tests), v němž takové testy měly být vypracovány; předčasná smrt však přerušila jeho plány. I tak ale vznikly další mezinárodní projekty, které se inspirovaly jeho myšlenkami a jejichž účelem bylo vyhodnotit relevantnosti testů na buněčných kulturách a tím nahradit testy na zvířatech.
Ilustrační foto: Stanislava Kyselová, Akademický bulletin
Roli v prosazování alternativních metod sehrály dvě organizace: FRAME (Fund for the Replacement of Animals in Medical Experiments), která byla založena v Anglii v roce 1969, a v průběhu posledních zhruba 20 let ECVAM (European Centre for Validation of Alternative Methods), již v roce 1992 založila Evropská unie. Za poslední dobu vzniklo několik mezinárodních projektů (ACuteTox, Sens-it-iv, ReProTect) financovaných a řízených ECVAM. Například projekt ACuteTox (2005–2009) přímo navazoval na projekty MEIC a EDIT a zabýval se optimalizací a vyhodnocením testů v buněčných kulturách a též jejich praktickým zavedením pro použití při testování průmyslově vyráběných chemických látek (např. kosmetických přípravků, léků, čisticích prostředků, chemických hnojiv apod.). Je těžké zákonodárné orgány přesvědčit, aby změnily postoj a upřednostnily testování toxického účinku chemických látek na buněčných kulturách před testováním na zvířatech.
Tento přístup je obzvláště aktuální v současné době, kdy EU zavedla systém REACH (Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals), v jehož rámci musí být otestováno na toxicitu kolem 30 000 chemikálií vyráběných v množství přesahujícím jednu tunu za rok. Vědci vypočetli, že testování na zvířatech by si vyžádalo nejméně čtyři miliony pokusných zvířat (podle některých odhadů dokonce až 12 milionů) a trvalo by desítky let. Je proto aktuální vypracovat v mezinárodní spolupráci sadu buněčných testů vhodných pro testování průmyslových chemických látek. První výsledky úsilí jsou zřetelné již v současnosti: od roku 2009 je v zemích EU zakázáno používat experimenty na zvířatech pro testování kosmetických sloučenin (cosmetic ingredients) s výjimkou některých testů, jež potrvají do roku 2013. Stanovisko EU je formulováno následujícím způsobem: pokusy na zvířatech se nemají používat, pokud existuje alternativa; počet používaných pokusných zvířat má být co nejmenší. Rovněž zákonodárství o chemikáliích zdůrazňuje, že testování na zvířatech musí být poslední možností a žádné testy se nemají dělat bez absolutní nutnosti. Formulace v zákonodárství však nejsou příliš jasné a nevyžadují okamžité zavádění nových testovacích metod; zákon proto potřebuje další upřesnění.
Björn Ekwall přikládal velký důraz osobním kontaktům a diskusím mezi vědci; proto již v roce 1983 založil spolu s významným švédským neurotoxikologem prof. Erikem Walumem Skandinávskou společnost pro buněčnou toxikologii (The Scandinavian Society for Cell Toxicology, SSCT), která byla od samého počátku koncipována jako diskusní klub skandinávských buněčných toxikologů. Později se ke společnosti připojili i další evropští vědci a každoroční workshopy se začaly pořádat i mimo Skandinávii – například v Estonsku, Německu, Polsku nebo ve Velké Británii. V České republice se podobný workshop uskutečnil v roce 2009 (Lázně Sedmihorky) a byl velice úspěšný. Sešli se na něm vědci z 11 evropských zemí; účastníci z ČR tvořili zhruba polovinu z celkového počtu 41 účastníků.
Tradiční součástí workshopů je udílení Pamětní ceny Björna Ekwalla a s ní spojená zvaná přednáška. Od roku 2002 tuto cenu každoročně uděluje B. Ekwall Memorial Foundation (BEMF; www.bemf.eu) ve Stockholmu spolu se SSCT. Mezi držiteli ocenění jsou významní vědci ze Skandinávie i z jiných evropských zemí. Laureátem pro rok 2012 se stal čelný vědec v oboru buněčné toxikologie a alternativních metod prof. Horst Spielmann z Freie Universität v Berlíně, který vypracoval nové buněčné modely pro testování toxických látek, dnes používané již po celém světě.
Úsilím a angažovaností buněčných toxikologů se podařilo ve vývoji alternativních metod docílit značného pokroku. Nutno také zdůraznit spolupráci buněčných toxikologů jak ze Skandinávie, tak i celé Evropy v jejich úsilí o co nejrychlejší dosažení změny legislativy, aby se toxické látky testovaly na buňkách v kulturách, nikoli na experimentálních zvířatech.
ADA KOLMANOVÁ,
předsedkyně Björn Ekwall Memorial Foundation,
Stockholm, Švédsko