English
Tuto otázku si kladou lidé již od počátku lidstva. Pro členy Laboratoře biochemie a molekulární biologie zárodečných buněk v Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR v Liběchově je odpověď jasná, jelikož na počátek vzniku nového jedince nahlíží prostřednictvím molekulární biologie. První bylo vajíčko.
Všechna fota: Archiv ÚŽFG AV ČR
Náš současný výzkum se orientuje na pochopení osudu mediátorové RNA (mRNA) v savčím vajíčku a tvorbu proteinů podle vzorce této mRNA. Zároveň se věnujeme i dalším dějům, které jsou důležité pro zdárný vývoj vajíčka a následně, po oplození, pro zdravý vývoj embrya. Je známo, že při dosažení vyššího věku se u žen často vyskytuje nesprávné množství genetické informace v embryu (aneuploidie). Jakým mechanismem dochází k těmto poruchám, však zůstává stále nevyřešenou otázkou.
1. Myší oocyty, finální fáze maturace čekající na oplození, zobrazeno v průchozím světle optického mikroskopu; 2. Detail lokalizace proteinu 4-EBP1 (červená barva) ve stádiu GVBD do blízkosti kondenzovaných chromozómů (modrá barva); 3. Nascentní proteosyntéza po GVBD (červená barva). Možné sledovat dvě oblasti: silný signál v oblasti chromozómů a druhý v oblasti endoplasmatického retikula.
Savčí vajíčko je bezesporu jedinečná a pozoruhodná buňka, která před oplozením musí dozrát, aby mohla přijmout spermii. Během růstové fáze nahromadí vajíčko všechnu RNA důležitou nejen pro dokončení meiózy a oplození, ale i pro počáteční vývoj embrya. Ve vajíčku se totiž regulace genové exprese odehrává převážně na úrovni stabilizace RNA, proteinů, a zahájení (iniciace) translace, po které dochází k syntéze proteinů. mRNA se skládá z kódující a nekódující sekvence, které určují její osud v buňce. Právě nekódující počáteční úsek mRNA nacházející se na jejím 5’ konci je odpovědný za iniciaci translace. Případné zastavení syntézy proteinů se děje nejčastěji během iniciačního kroku, jenž je tedy stěžejním bodem translace. Obecně jsou známy dva mechanismy iniciace translace regulované pomocí 5’ konce mRNA: závislý na čepičce (cap-dependentní) a nezávislý na čepičce (zprostředkovaný IRES, Internal Ribosome Entry Site). Tým Michala Kubelky se věnuje cap-dependentní translaci. Dokázal, že tento proces je masivně aktivován po rozpadu jaderné membrány vajíčka při znovuzahájení meiózy a deaktivován po proniknutí spermie do vajíčka. V souvislosti s těmito poznatky není překvapivé, že cap-dependentní translace významně ovlivňuje fyziologii této buňky. Ačkoli není problematika regulace translace prozatím plně rozklíčována, prostřednictvím intenzivního rozvoje zejména molekulárních a bioinformatických metod se tato oblast v současnosti rychle vyvíjí. Studium translace je možné zejména pomocí biochemických a molekulárních metod, jako jsou imunoblot, polyadenylační test, imunocytochemie, metabolické značení a kinázové testy.
1. Dělící vřeténko v detailu MI, chromozómy (modrá barva), mikrotubuly (červená barva), centromery (zelená barva); 2. Dělící vřeténko ukazuje normální rozložení chromozómů; 3. Dělící vřeténko a abnormální rozložení chromozómů ve vajíčku po potlačení syntézy specifických proteinů.
Iniciace cap-dependentní translace je několikastupňový proces. Začíná rozeznáním čepičky na 5’ konci mRNA pomocí eukaryotického iniciačního faktoru (eIF4E) a vytvořením pre-iniciačního komplexu. Molekuly mRNA jsou poté stočeny do kruhu pomocí aktivačních faktorů vázaných na 5’ a 3’ nekódujících koncích. Pod vedením Andreje Šušora se členové laboratoře dále zaměřili na molekulární dráhu regulovanou pomocí kinázy mTOR (mam-malian Target Of Rapamycin). Tato serin/threoninová kináza je důležitá pro regulaci translace specifických mRNA a má tak vliv na fyziologii buňky. Hlavní funkcí mTOR je deaktivace přirozeného inhibitoru translace, kterým je protein 4E-BP1. Ve vajíčku před zahájením meiózy je velké množství proteinu 4E-BP1, jenž potlačuje translaci vazbou na eIF4E, čímž blokuje jeho vazbu na další faktory a cirkularizaci mRNA. Při zahájení meiózy se aktivuje mTOR, který prostřednictvím fosforylace deaktivuje 4E-BP1. Pozoruhodné je, že 4E-BP1 je inaktivován v oblasti chromozomů a nově vznikajícího meiotického vřeténka této obrovské buňky, což nasvědčuje tomu, že v této oblasti dochází k masivní translaci. Zásadní je i zjištění, že se značná populace mRNA nachází právě v jádře vajíčka. Po znovuzahájení meiózy se rozpadne jaderná membrána a mRNA zadržená v jádře je translatována v oblasti chromozomů a meiotického vřeténka. Zjištění ukazují, že jádro vajíčka uchovává specifickou mRNA tím, že brání její translaci a následně zůstává v oblasti chromozomů. Zde je pomocí mTOR kinázy aktivována syntéza proteinů de novo. Savčí vajíčko si tak vyvinulo mechanismus, který zabezpečí, že důležité proteiny jsou přítomné ve správný čas na správném místě.
Modelový organismus mus musculus CD1 kmen.
Z těchto výsledků lze vyvodit, že nesprávná lokalizace mRNA a její defektní translace přispívá ke vzniku aneuploidií u vajíček žen, obdobně jako je tomu u vajíček laboratorních myší. Další studium a nové poznatky umožní eliminaci těchto poruch dříve, než vznikne nový lidský život.
DENISA JANSOVÁ,
Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, v. v. i.